日本神経化学会奨励賞受賞者研究紹介

幼少期逆境体験による前頭前野–視床室傍核回路への影響と社会性行動への関与

山室 和彦

奈良県立医科大学　精神医学講座

幼少期の社会的孤立は成人期の社会性行動を低下させるが、その神経回路のメカニズムの詳細は不明のままである。本研究では離乳直後の2週間の社会的隔離により、新規マウス曝露時に視床下部後部に投射する内側前頭前野（mPFC→pPVT）錐体細胞が活性化しないことを明らかにした。それに基づき、mPFC→pPVT神経回路の活動を光遺伝学的手法にて抑制すると社会性行動障害がみられた。また、幼若期隔離によって、成体期でmPFC→pPVT投射錐体細胞の細胞興奮性が低下し、ソマトスタチン発現低閾値スパイクインターニューロンからの抑制性入力が増加するという社会性行動障害を引き起こす神経回路メカニズムを明らかにした。さらに、mPFC→pPVT神経回路を光遺伝学的に活性化することで、幼若期隔離による社会性行動障害を改善できることが示唆された。本研究では、社会性行動に必要なmPFC→pPVT投射錐体細胞の細胞興奮性およびその関連する抑制性回路が幼若期の社会的経験によって大きく影響を受けることを明らかにした。

社会的孤独がメンタルヘルスへの深刻な脅威として注目されるようになっている1–3）。特に幼少期の社会的孤立は、ヒトだけでなく哺乳類の成体期の社会性行動に悪影響を与える4–7）。幼少期に里親に預けられて社会的に恵まれない施設の養育環境から離れた子どもは、里親に預けられたことがない子どもや、後の年齢で里親に預けられた子どもと比較して、機能的転帰が不良であると報告されている6, 7）。マウスの離乳直後2週間（生後21～35日齢）のみ1匹飼いをする幼若期隔離マウスモデル（jSI: juvenile social isolation）は、成体期での社会性行動の低下につながる5）。これは、幼若期の社会的経験が成体期の社会性行動の確立にとって敏感な時期であることを示唆している。また、ヒトと齧歯動物での多くの研究は社会性行動を調節する脳ネットワークの重要な中枢として内側前頭前野（mPFC: medial prefrontal cortex）が広く知られている8）。マウスの最近の研究ではmPFCの皮質下に投射する深層の錐体細胞が幼若期隔離に対して脆弱であり、成体期での錐体細胞の細胞興奮性とシナプス駆動を低下させることが報告されているが9）、皮質下投射部位は不明のままであった。そのため、社会性行動を構築するために幼若期の社会的経験を必要とするmPFC→皮質下領域の神経回路の特定を試みた。

mPFC→pPVT神経回路は社会性行動に重要

mPFCからの投射を受け取るどの皮質下領域が社会性行動に重要であるかを検証するために、まず初期遺伝子c-Fosを用いて全脳マッピングを行った。後部視床室傍核（pPVT: posterior paraventricular nucleus thalamus）が、最も強く反応したのが新規マウスへの暴露、次に新規オブジェクトへの暴露、続いて暴露なしの順であった。次にpPVTに投射するmPFC深層の錐体細胞は、グループ飼育（GH: group housing）マウスでは新規オブジェクトへの曝露と比較して新規マウスへの曝露によって活性化されたが、一方でjSIマウスではその活性化がみられなかった。さらにファイバーフォトメトリーを用いて、社会性行動中のmPFC→pPVT投射錐体細胞のリアルタイム活動を検証した。GCaMP6fを発現するmPFC→pPVT投射錐体細胞は、GHマウスに新規オブジェクトを暴露するよりも、新規マウスを暴露した方がより強力に活性化されたが、jSIマウスではその活性がみられなかった。これらの結果から、社会性行動に関わるmPFC→pPVT神経回路が適切に構築されるためには、幼若期の社会的経験が必要であることが示唆された。mPFC→PVT投射錐体細胞の活動が社会性に必要であることをさらに検証するため、pPVTのmPFC投射末端の活動を光遺伝学的手法により抑制を行った。CaMKIIプロモーター下でeNpHR3.0を発現するAAVウイルスをmPFCに注入し、pPVT上に埋め込まれた黄色の発光ダイオード（LED）をワイヤレスで照射することにより、mPFC→pPVT神経回路を選択的に抑制した。この操作は、pPVTの細胞の活動を部分的に低下させるが、不安関連または運動行動に影響を与えることなく社会性行動を低下させた。一方でmCherryを発現する対照マウスでは行動への影響はなかった。重要なことに、この操作は自然の食物嗜好に影響を与えなかったことから、社会性行動の低下は自然の報酬関連行動の結果ではないことが示唆されている。つまり、これらの結果はmPFC→pPVT投影錐体細胞と社会性行動との間の因果関係を示しているといえる。

mPFC→pPVT神経回路の活性化がGHマウスの社会性を高めるかについて光遺伝学的手法と3chamberを用いて検証した。CaMKIIプロモーター下でチャネルロドプシン（ChR2: channel rhodopsin 2）を発現するAAVウイルスをmPFCに注入し、pPVT上に埋め込まれた青色LEDをワイヤレスで照射することにより、mPFC→pPVT神経回路を選択的に活性化した。3chamberの片方のチャンバーには新規マウスを、もう片方には新規オブジェクトを入れ、それらの周囲でのみ活性化を行ったところ、新規マウス周囲の活性化は新規マウスへの、新規オブジェクト周囲の活性化は新規オブジェクトへの接触時間を増加させた。さらに、3chamberでいずれのチャンバーも空にした状態で、片方のチャンバーでのみ活性化を行ったところ、活性化を行ったチャンバーでの探索時間が増加した。この効果は、光刺激の終了後すぐに消えた。これらの結果から、mPFC→pPVT神経回路の光遺伝学的手法による活性化は、社会性を高めるために活用できる可能性が示唆された。

幼若期の隔離によるmPFC→pPVT神経回路の細胞興奮性の低下と自発的抑制性シナプス後電流の増加

次に幼若期隔離によって引き起こされたmPFC→pPVT神経回路を細胞および回路レベルのメカニズムの解明のためホールセルパッチクランプ法を用いた。jSIマウスのmPFC→PVT投射錐体細胞はGHマウスと比較して、細胞興奮性の低下と自発的抑制性シナプス後電流（sIPSC: spontaneous inhibitory postsynaptic current）の頻度が有意に増加した。さらに、jSIマウスではGHマウスと比較して自発性興奮性シナプス後電流（sEPSC: spontaneous excitatory postsynaptic current）の頻度が減少する傾向がみられた。これらの変化は、GHマウスと比較してjSIマウスでのmPFC→PVT投射錐体細胞におけるsEPSC/sIPSC頻度の比（E/I ratio）の有意な減少につながることが明らかになった。注目すべきことに、生後35日齢（生後21日から2週間隔離飼育をした最終日）では幼若期隔離の影響はみられなかった。つまり、幼若期隔離の効果は成体期になった初めて観察されるといえる。幼若期隔離の影響がmPFC→PVT投射錐体細胞において特異的であることを検証するため、側坐核および対側mPFCへの投射錐体細胞を同様の方法を用いて検証行ったが、細胞興奮性およびE/I ratioに影響はみられなかった。これらの結果から、mPFC→pPVT投射錐体細胞および関連する抑制性回路が幼若期隔離に対して特に脆弱であることが示唆される。

mPFC→pPVT神経回路の機能的障害を検証するために、ChR2を発現するAAVウイルスをmPFCに注入する光遺伝学的手法を用いた活性化と、pPVT神経細胞からのホールセルパッチクランプ法を組み合わせることで行った。GHおよびjSIマウスでもpPVT神経細胞の大部分は誘発反応を示した。一方で、GHマウスと比較してjSIマウスでは、シナプスの放出機構（PPR: paired pulse inhibition）に違いはみられなかった。一方で、幼若期隔離がpPVT神経細胞へ誘発された興奮性シナプス伝達の持続的な減少を引き起こすことが示唆された。また、mPFC→pPVT投射錐体細胞とは対照的に、pPVT神経細胞自体は幼若期隔離による影響はみられなかった。

mPFCにおけるソマトスタチン発現低閾値スパイク（LTS-SST: low-threshold-spiking somatostatin）インターニューロンのサブグループは、GHマウスと比較してjSIマウスの細胞興奮性が増加し、このインターニューロンのeDREADD（excitatory designer receptors exclusively activated by designer drugs）による化学遺伝学的手法を用いた選択的な活性化はGHマウスの社会性行動を低下させた。これらの結果は、幼若期隔離がLTS-SSTインターニューロンの活動を増加させ、mPFC→pPVT投射錐体細胞の活動の低下と社会性行動の低下に寄与することが示唆される。

幼若期隔離マウスにおけるmPFC→pPVT神経回路の活性化による社会性行動障害の改善

次に、mPFC→pPVT神経回路の活性化がjSIマウスの社会性行動を改善させるかについて光遺伝学的手法と3chamberを用いて検証した。CaMKIIプロモーター下でChR2を発現するAAVウイルスをmPFCに注入し、pPVT上に埋め込まれた青色LEDをワイヤレスで照射することにより、mPFC→pPVT神経回路を選択的に活性化した。結果として、不安関連または運動行動に影響を与えることなく、jSIマウスでみられる社会性行動の低下を改善させた。一方で、mCherryを発現するコントロールjSIマウスではいずれのタスクにおいても影響がみられなかった。

最後にmPFC→pPVT神経回路を選択的で持続的な活性化がjSIマウスの社会性行動の持続的な改善につながるのかを検証した。具体的には、3chamberの片方のチャンバーには新規マウスを、もう片方には新規オブジェクトを入れ、連続2日間、新規マウスの周辺でのみ同回路を活性化させ翌日は光刺激なしで同様の実験を行ったところ、社会性行動の改善が持続した。これらの結果から、光遺伝学的手法による社会性行動の改善は一過性のみではなく、連続で刺激することにより持続することが明らかになった。

今回の研究では、mPFC→pPVT神経回路は幼若期の社会的経験によって影響を受けること、成体期での社会性行動に必要であることがわかった。mPFC→pPVT神経回路は幼若期の社会的経験による影響は生後35日齢（隔離期間の最終日）では観察されず、成体期になって初めてみられるということは生後35日齢からの環境によって引き起こされた可能性が示唆される。幼若期の行動の可塑性には臨界期がある可能性があり、一度閉じられると社会的戦略を調整することができないかもしれない。PVTが、側坐核、分界条床核、および扁桃体中央部を含むさまざまな報酬関連領域へ投射することを考えると10, 11）、mPFC→pPVT神経回路は脳ネットワークのトップダウン制御にとって重要な役割を演じている可能性がある。SSTインターニューロンの多様なサブタイプの中で、LTS-SST細胞は12）、ゆっくりとしたリズミカルなバースト活動とリバウンド励起を通じて、mPFCから皮質下に投射する深層錐体細胞の長期同期発火を開始および維持に関与していることが報告されている13）。したがって、LTS-SST細胞は、mPFC→pPVTニューロンをリズミカルに活性化し、mPFC-pPVTの同期を促進することにより、社会性行動において極めて重要な役割を果たしている可能性がある。

今回の研究（図1）によってmPFCの社会性行動に関連するネットワークの複雑さに新たな神経回路が追加されることになるが、マウスの社会性行動中のmPFCの錐体細胞の多様な活性化パターンを示す最近の研究と一致している14–17）。mPFCから外側手綱核への投射などは、その神経回路が活性化された時に社会性行動が低下するが18–21）、mPFC→PVT投射錐体細の活性化と同様に、小脳からと腹側被蓋野への投射は、同回路の活性化により社会性行動が高まることが報告されている22）。mPFC投射錐体細胞のさまざまな集団が如何に社会的行動を制御し、さらには皮質下ネットワークにどのように影響するかを明らかにするためにはさらなる研究が必要である。

図1 mPFC-pPVT神経回路と社会性行動

以前の遺伝的および転写学的研究は、自閉症および統合失調症の多くのリスク遺伝子が胎児および乳児のmPFCのL5/6錐体細胞で高度に発現していることが報告されている23, 24）。齧歯動物の研究では、自閉症リスク遺伝子をノックアウトしたマウスモデルでmPFCの皮質下に投射するL5/6錐体細胞の機能が障害されることも報告されている20）。mPFC→pPVT投射錐体細胞および関連するLTS-SSTインターニューロンは、経験依存的で、社会環境にも敏感であるため、経頭蓋磁気刺激および経頭蓋直流などの非侵襲的技術を使用することで精神疾患における社会性行動障害の有望な治療ターゲットとなることが期待される。

倫理的配慮

本論文に記載した筆者らの研究に関して全て倫理的配慮を行っている。

利益相反

開示すべき利益相反は存在しない。

1) Cacioppo JT, Cacioppo S. The growing problem of loneliness. Lancet, 391(10119), 426 (2018).

2) Miller G. Social neuroscience.Why loneliness is hazardous to your health. Science, 331(6014), 138–140 (2011).

3) Pitman A, Mann F, Johnson S. Advancing our understanding of loneliness and mental health problems in young people. Lancet Psychiatry, 5(12), 955–956 (2018).

4) Freedman DG, King JA, Elliot O. Critical period in the social development of dogs. Science, 133(3457), 1016–1017 (1961).

5) Makinodan M, Rosen KM, Ito S, Corfas G. A critical period for social experience-dependent oligodendrocyte maturation and myelination. Science, 337(6100), 1357–1360 (2012).

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7) Almas AN, Degnan KA, Nelson CA, Zeanah CH, Fox NA. IQ at age 12 following a history of institutional care: Findings from the Bucharest Early Intervention Project. Dev Psychol, 52(11), 1858–1866 (2016).

8) Bicks LK, Koike H, Akbarian S, Morishita H. Prefrontal cortex and social cognition in mouse and man. Front Psychol, 6, 1805 (2015).

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10) Kirouac GJ. Placing the paraventricular nucleus of the thalamus within the brain circuits that control behavior. Neurosci Biobehav Rev, 56, 315–329 (2015).

11) Dong X, Li S, Kirouac GJ. Collateralization of projections from the paraventricular nucleus of the thalamus to the nucleus accumbens, bed nucleus of the stria terminalis, and central nucleus of the amygdala. Brain Struct Funct, 222(9), 3927–3943 (2017).

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20) Brumback AC, Ellwood IT, Kjaerby C, Lafrti J, Robinson S, Lee AT, Patel T, Nagaraj S, Davatolhagh F, Soha VS. Identifying specific prefrontal neurons that contribute to autism-associated abnormalities in physiology and social behavior. Mol Psychiatry, 23(10), 2078–2089 (2018).

21) Yizhar O, Fenno LE, Prigge M, Schneider F, Davidson TJ, O’Shea DJ, Sohal VS, Goshen I, Finkelstein J, Paz JT, Stehfest K, Fudim R, Ramakrishnan C, Huguenard JR, Hegemann P, Deissroth K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature, 477(7363), 171–178 (2011).

22) Carta I, Chen CH, Schott AL, Dorzan S, Khodakhah K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science, 363(6424), eaav0581 (2019).

23) Willsey AJ, Sanders SJ, Li M, Dong S, Tebenkamp AT, Muhle RA, Reilly SK, Lin L, Fertuzinhos S, Miller JA, Murtha MT, Bichsel C, Niu W, Cotney J, Ercan-Sencicek AG, Gockley J, Gupta AR, Han W, He X, Hoffman EJ, Klei L, Lei J, Liu W, Liu L, Lu C, Xu X, Zhu Y, Mane SM, Lein ES, Wei L, Noonan JP, Roeder K, Devlin B, Sestan N, State MW. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell, 155(5), 997–1007 (2013).

24) Bakken TE, Miller JA, Ding SL, Sunkin SM, Smith KA, Ng L, Szafer A, Dalley RA, Royall JJ, Lemon T, Shapouri S, Aiona K, Arnold J, Bennett JL, Bertagnolli D, Bickley K, Boe A, Brouner K, Butler S, Byrnes E, Caldejon S, Carey A, Cate S, Chapin M, Chen J, Dee N, Desta T, Dolbeare TA, Dotson N, Ebbert A, Fulfs E, Gee G, Gilbert TL, Goldy J, Gourley L, Gregor B, Gu G, Hall J, Haradon Z, Haynor DR, Hejazinia N, Hoerder-Suabedissen A, Howard R, Jochim J, Kinnunen M, Kriedberg A, Kuan CL, Lau C, Lee CK, Lee F, Luong L, Mastan N, May R, Melchor J, Mosqueda N, Mott E, Ngo K, Nyhus J, Oldre A, Olson E, Parente J, Parker PD, Parry S, Pendergraft J, Potekhina L, Reding M, Riley ZL, Roberts T, Rogers B, Roll K, Rosen D, Sandman D, Sarreal M, Shapovalova N, Shi S, Sjoquist N, Sodt AJ, Townsend R, Velasquez L, Wagley U, Wakeman WB, White C, Bennett C, Wu J, Young R, Youngstrom BL, Wohnoutka P, Gibbs RA, Rogers J, Hohmann JG, Hawrylycz MJ, Hevner RF, Molnár Z, Phillips JW, Dang C, Jones AR, Amaral DG, Bernard A, Lein ES. A comprehensive transcriptional map of primate brain development. Nature, 535(7612), 367–375 (2016).